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原代細胞的培養：

原代細胞的培養是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養。因此，較為嚴格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養，此時(shí)的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實(shí)際上，通常把第十代以?xún)鹊呐囵B細胞統稱(chēng)為原代細胞培養。

原代細胞的培養有組織塊培養和分散細胞培養。

組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基后進(jìn)行培養。

分散細胞培養大致步驟為:

將動(dòng)物組織從機體中取出離散成單個(gè)細胞(常用)，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長(cháng)和繁殖(注意整個(gè)過(guò)程無(wú)菌)。

原代細胞操作方法：

（1）取成年新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射空氣處死后，取下兔子的雙腿，立即用75%乙醇浸泡。

（2）移入細胞房?jì)?，去除雙腿表面的皮毛及肌肉，剪取關(guān)節段，移至超菌工作臺內。

（3）PBS洗滌數次，用手術(shù)刀或彎剪將關(guān)節表面的軟骨組織取下。

（4）軟骨組織塊靜置5min，棄去上層液體及懸浮組織，將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化15-20min；

（5） 4℃靜置5min；棄上清，PBS洗滌，去上清。加入0.2%膠原酶II，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化2H；

（6）加入生長(cháng)培養基終止消化，反復吹打后依次通過(guò)200目濾網(wǎng)。收集濾液,1200rpm離心8min，棄上清，用DMEM*培養基重新懸浮細胞, 放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

（7）細胞傳代后放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養板中進(jìn)行培養。細胞*展開(kāi)后即可固定做原代鑒定。

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